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    血液乙醛脫氫酶2活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書(中文版)

    主要用途

    GENMED血液乙醛脫氫酶2活性光度法定量檢測試劑盒是一種旨在使用乙醛脫氫酶2敏感性抑制劑,通過檢測反應系統中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)還原后峰值的增高,即采用光度法來測定血液樣品中酶活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種動物和人體血液樣品(血漿、血清、紅細胞等)乙醛脫氫酶2的特異活性檢測。產品嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定。

    技術背景

    乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase;ALDH;EC1.2.1.3),又稱為乙醛NAD氧化還原酶(aldehyde NAD- oxidoreductase)是一類NADP)依賴性酶,催化廣譜的外源性或內源性脂肪族和芳香族乙醛類底物氧化,包括乙醇、氨基酸、生物胺(biogenic amine、維生素、固醇類、脂質、藥物和環境分子等代謝產物。乙醛脫氫酶是乙醇在體內分解代謝過程中兩種主要酶之一。乙醛脫氫酶把乙醛中的兩個氫原子脫掉,使乙醛轉化為乙酸,生成的乙酸進入脂肪酸氧化途徑,最終被氧化成二氧化碳和水。乙醛脫氫酶主要有兩種同工酶:ALDH1ALDH2。ALDH1存在于胞液中,ALDH2存在于線粒體中,ALDH2ALDH1的活性高。乙醛脫氫酶的缺少,使酒精不能被完全分解為水和二氧化碳,而是以乙醛繼續留在體內,使人喝酒后產生惡心欲吐、昏迷不適等醉酒癥狀。基于來自于乙醇代謝產生的乙醛(acetaldehyde),在7-羥基-3-4-羥苯基)-異黃酮-7-糖苷(Daidzein-7-O-β-D-glucopyranoside;Daidzin存在與否的情況下,乙醛脫氫酶2的催化作用,轉化為乙酸(acetic acid)產物后,通過測定反應體系中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸oxidized reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NAD)轉化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)的變化340nm 波長),來定量分析乙醛脫氫酶2的特異活性。乙醛脫氫酶2反應系統為:

    產品內容

    GENMED清理液(Reagent A 毫升

    GENMED裂解液(Reagent B 毫升

    GENMED緩沖液(Reagent C 毫升

    GENMED反應液(Reagent D 毫升

    GENMED底物液(Reagent E   毫升

    GENMED陰性液(Reagent F   毫升

    GENMED專性液(Reagent G   微升

    產品說明書    1

    保存方式

    保存GENMED緩沖液(Reagent C)、GENMED反應液(Reagent D)、GENMED底物液(Reagent E)和GENMED專性液(Reagent G在-20℃冰箱里;其余的保存在4℃冰箱里;GENMED反應液(Reagent D)和GENMED底物液(Reagent E避免光照;有效保證6

    用戶自備

    1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器

    15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器

    (微型)臺式離心機:用于樣品制備

    比色皿或96孔板:用于光度分析的容器

    分光光度儀或酶標儀:用于光度分析

    實驗步驟

    一、 樣品準備

    選擇一:血漿樣品

    1. 準備好肝素、ACDEDTA等抗凝管

    2. 抽取1毫升血液,置于抗凝管里

    3. 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘,速度為700g3000RPM,例如eppendorf 5415

    4. 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血漿成分(注意:避免觸碰白色液體層

    5. 即刻置于冰槽里備用或放進-70℃冰箱里保存

    6. (選擇步驟)移取10微升進行蛋白定量測定 (注意:建議使用GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-GMS30030.1

    選擇二:血清樣品

    1 準備好不含抗凝劑的儲存管 

    2. 抽取1毫升血液,置于儲存管里

    3. 室溫下,靜置30分鐘,直至血液凝結

    4. 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘,速度為2000g5000RPM,例如eppendorf 5415

    5. 小心移取上層黃色液體到新的1.5毫升離心管――此為血清成分(注意:避免觸碰白色液體層

    6. 即刻置于冰槽里備用或放進-70℃冰箱里保存

    7. (選擇步驟)移取10微升進行蛋白定量測定 (注意:建議使用GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-GMS30030.1

    選擇:紅細胞樣品

    1. 準備好肝素、ACDEDTA等抗凝管

    2. 抽取1毫升血液,置于抗凝管里

    3. 轉移到15毫升錐形離心管

    4. 放進4℃臺式離心機離心30分鐘,速度為200g(或1000RPM,例如eppendorf 5815

    5. 小心抽去上清液

    6. 加入xx毫升GENMED清理Reagent A,混勻

    7. 放進4℃臺式離心機離心7分鐘,速度為1200g(或2500RPM,例如eppendorf 5815

    8. 小心抽去上清液

    9. 重復實驗步驟68二次

    10. 加入xx毫升預冷GENMED裂解液Reagent B

    11. 渦旋震蕩15

    12. 放進4℃臺式離心機離心7分鐘,速度為1200g(或2500RPM,例如eppendorf 5815

    13. 小心移取上清液到新的15毫升離心管

    14. 即刻置于冰槽里備用或放進-70℃冰箱里保存

    15. (選擇步驟)移取10微升進行蛋白定量測定 (注意:建議使用GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-GMS30030.1

    二、 測定準備

    1. 開啟并設定好分光光度儀(溫度為25℃):波長340nm,間隔60秒,讀數5次(共5分鐘),并置零 

    2. 從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化;GENMED底物液(Reagent E避免光照;GENMED緩沖液(Reagent C置于室溫下均衡溫度

    三、 背景對照測定

    1. 移取xx微升GENMED緩沖液(Reagent C到新的比色皿

    2. 加入xx微升GENMED反應液(Reagent D

    3. 加入xx微升GENMED底物液(Reagent E

    4. 25℃溫度下孵育3分鐘(注意:如果背景有波動,可以延長孵育時間30分鐘)

    5. 加入xx微升GENMED陰性液(Reagent F

    6. 上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)

    7. 即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照(5分鐘讀數-0分鐘讀數)

    四、 樣品總活性測定

    1. 移取xx微升GENMED緩沖液(Reagent C到新的比色皿

    2. 加入xx微升GENMED反應液(Reagent D

    3. 加入xx微升GENMED底物液(Reagent E

    4. 25℃溫度下孵育3分鐘

    5. 加入20微升待測樣品(或200微克蛋白)(注意:樣品須清澈

    6. 上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)

    7. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數5分鐘讀數-0分鐘讀數) 

    五、 樣品非特異活性測定

    1. 移取xx微升GENMED緩沖液(Reagent C到新的比色皿

    2. 加入xx微升GENMED專性液(Reagent G

    3. 加入20微升待測樣品(或200微克蛋白)(注意:樣品須清澈

    4. 上下傾倒數次,混勻

    5. 25℃溫度下孵育10分鐘

    6. 加入xx微升GENMED緩沖液(Reagent C

    7. 加入xx微升GENMED反應液(Reagent D

    8. 加入xx微升GENMED底物液(Reagent E

    9. 上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)

    10. 即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品讀數5分鐘讀數-0分鐘讀數) 

    六、計算樣品活性

    1)樣品活性(總活性或非特異活性)

    2)樣品特異活性

    七、 酶標儀測定

    1. 背景對照和樣品總活性

    1. 96孔板上做好相應標記:背景對照、樣品總活性

    2. 分別移取xx微升GENMED緩沖液(Reagent C96孔板

    3. 分別加入xx微升GENMED反應液(Reagent D

    4. 分別加入xx微升GENMED底物液(Reagent E

    5. 25℃溫度下孵育3分鐘(注意:如果背景有波動,可以延長孵育時間30分鐘)

    6. 分別加入xx微升GENMED陰性液(Reagent F待測樣品(或200微克蛋白)到相應孔(注意:樣品須清澈

    7. 輕輕搖動96孔板

    8. 即刻放進酶標儀檢測:0分鐘讀數和5分鐘讀數

    2. 樣品非特異活性

    1. 96孔板上做好相應標記:樣品非特異活性

    2. 移取xx微升GENMED緩沖液(Reagent C96孔板

    3. 加入xx微升GENMED專性液(Reagent G

    4. 加入5微升待測樣品(或200微克蛋白)(注意:樣品須清澈

    5. 輕輕搖動96孔板

    6. 25℃溫度下孵育10分鐘

    7. 加入xx微升GENMED緩沖液(Reagent C

    8. 加入xx微升GENMED反應液(Reagent D

    9. 加入xx微升GENMED底物液(Reagent E

    10. 輕輕搖動96孔板

    11. 即刻放進酶標儀檢測:0分鐘讀數和5分鐘讀數

    3. 計算樣品活性

    1)樣品活性(總活性或非特異活性)

    2)樣品特異活性


    注意事項

    1. 本產品為20次(比色皿;10個樣本)和80次(96孔板;40個樣本)操作,包括背景對照

    2. 操作時,須戴手套

    3. 如果檢測干擾過大,建議進行樣本背景對照

    4. 系統操作過程中,背景測定只需1

    5. 建議使用比色皿測定

    6. 樣品須澄清,至關重要 

    7. 加樣后3秒內光度測定

    8. 測定值由低到高變化;測定可持續5分鐘

    9. 光度測定后,比色皿須清洗徹底

    10. 樣本測定5分鐘讀數高于0分鐘讀數表明具有酶活性

    11. 建議待測樣本蛋白濃度為200微克/20微升 (本公司提供 GENMED Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-GMS30030.1

    12. 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調整樣品濃度

    13. 乙醛脫氫酶的活性與底物具有一定的相關性,如果活性檢測不到,請與技術專家聯系

    14. 乙醛脫氫酶2單位活性定義為:在25℃,pH 8.0條件下,每分鐘內能夠轉化1微摩爾氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD)為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作為一個活性單位

    15. 本公司提供系列乙醇代謝酶類檢測試劑產品

    質量標準

    1. 本產品經鑒定性能穩定

    2. 本產品經鑒定檢測敏感

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