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    Megazyme K-AMYL 直鏈淀粉/支鏈淀粉[膠淀粉]試劑盒(中文)

    前言:
    谷類淀粉的許多特性決定其最終用途,這些取決于直鏈淀粉/支鏈淀粉的比率。這些特性包括糊化和凝膠化,溶解度,抗性淀粉的形成以及整顆大米的烹飪和構造特性。因此,淀粉中直鏈淀粉含量的測定是淀粉加工的一個重要的質量參數。
    最常用的測定谷物淀粉中直鏈淀粉含量的方法是利用電勢,電流測定或直鏈淀粉的碘結合能力比色測定直鏈淀粉-碘色合配合物。然而,這些方法具有不確定性。支鏈淀粉-碘復合物也可以形成,這樣降低了利用非比色法測定的游離碘離子的濃度,并且用比色法測量時,該復合物可能和直鏈淀粉-碘復合物吸收相同波長的光。這種復合物致使直鏈淀粉的測定含量超過實際含量,需要進行校正。Gibson等詳細列舉了使用這些方法所遇到的許多其他問題。
    支鏈淀粉結合ConA的特殊復合物為淀粉中直鏈淀粉的測定提供了一種替代方法,而且不存在不確定性問題。在指定pH值,溫度和離子強度的條件下,ConA特異性結合分支多糖并形成沉淀,這種結合以多個非還原性末端基團上的α-D-吡喃葡萄糖基或α-D-吡喃甘露糖基單位為基礎。因此,ConA可以有效結合淀粉中的支鏈淀粉成分,但是不能結合線性為主的直鏈淀粉成分。
    此方法是Yun和Matheson改進的ConA方法。分析之前用乙醇預處理去除脂質。
    原理:
    淀粉樣品通過加熱完全地溶解在二甲基亞砜(DMSO)里。用乙醇沉淀淀粉去除其中的脂質,回收沉淀的淀粉。用醋酸/鹽溶液溶解沉淀的樣品,加入ConA,特異性沉淀支鏈淀粉,離心去除沉淀。單位體積上清液中的直鏈淀粉用酶水解為D-葡萄糖,然后用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑進行測定。另外一份單位體積醋酸/鹽溶液中的總淀粉同樣用酶水解為D-葡萄糖,然后加入葡萄糖氧化酶/過氧化物酶,用比色法測定。
    根據ConA沉淀樣品的上清液和與總淀粉樣品中的GOPOD在510 nm處的吸光光度值之比判斷直鏈淀粉在總淀粉中的含量。
    該方法適用于所有的純淀粉和谷物粉。
    精確性
    樣品如為純淀粉,相對標準偏差為<5%。
    樣品如為谷物面粉,相對標準偏差為~10%。
    試劑盒內容:
    瓶子1:凍干的Con A (伴刀豆球蛋白 A concanavalin A) ,200 mg,-20℃下穩定性>5年。
    瓶子2:淀粉葡糖苷酶【200U,條件為消化對硝基苯基β-麥芽糖苷(也就是3300U,條件為pH4.5,40℃下消化淀粉)】加上真菌α-淀粉酶(500U ,條件為pH5.0,40℃下消化 Ceralpha 試劑),2mL,4℃下穩定性>5年。
    瓶子3:GOPOD 試劑緩沖液。磷酸鉀緩沖液(1M,pH7.4),對羥苯甲酸(0.22M)和疊氮化鈉(0.02% W/W)。4℃下穩定性> 3年。
    瓶子4:GOPOD試劑酶。葡糖氧化酶(>12,000U)加上過氧化物酶(>650U)和4-氨基安替比林(80mg)。凍干粉,-20℃下穩定性>5年。
    瓶子5:D-葡萄糖標準溶液(5 mL,1.0mg/mL)溶于苯甲酸0.2%(w/v)。室溫下穩定性>5年。
    瓶子6:淀粉參考樣品(含有特定含量的直鏈淀粉),室溫下穩定性>5年。
    試劑制備的準備:
    1、用50mlCon A試劑將瓶子1中藥品溶解,分成適當的幾部分存放在聚丙烯管中,盡可能在-20℃下使用或冷藏。-20℃下穩定性>2年。
    2、用20ml醋酸鈉緩沖液將瓶子2中的藥品溶解,分成適當的幾部分存放在聚丙烯管中,盡可能在-20℃下使用或冷藏。-20℃下穩定性>2年。
    3、用蒸餾水將中的藥品(GOPOD 試劑緩沖液)稀釋至1L?,F配現用。
    (注意:如果瓶子3意外存放在-20℃下,一些鹽可能會結晶。配制時要確保所有的結晶物質都溶解在1L的蒸餾水中)
    4、用20ml GOPOD 試劑緩沖液溶解GOPOD試劑酶,并定量的轉移到存放GOPOD 試劑緩沖液的瓶子中,用鋁箔封住瓶子,避光保存。這種試劑黑暗中保存,2-5℃下能保存大約3個月,-20℃下穩定性大于12個月。
    5、按提供的方法使用D-葡萄糖標準溶液淀粉參考樣品,室溫下穩定性>5年。
    安全考慮:
    1、DMSO對皮膚有刺激性,用的時候要格外小心。它通過皮膚被吸收,對皮膚和眼睛都有刺激性。穿保護裝、戴手套,避免溶劑濺出。盡可能在通風櫥中進行試驗。
    2、ConA通過呼吸、皮膚接觸或攝入體內,對人體是十分有害的。這種傷害不可逆轉,可能會致畸。在使用ConA結晶體球蛋白和含有ConA的溶劑時要穿保護裝、戴手套和特制的面具。
    3、疊氮化鈉是有毒的化學試劑,必須要有專門的處理。它要添加特殊的緩沖液來充當防腐劑。毒性通過緩沖可以被消除,但是緩沖液必須在4℃下保存。
    緩沖液或溶劑:
    1、乙酸鈉緩沖液(10mM,pH 4.5)
    加5.9ml1.05g/ml的冰醋酸到900ml的蒸餾水中用4g/100ml的NaOH溶液調pH到4.5(大約30ml),加0.2g疊氮化鈉,用蒸餾水定容至1L。室溫下穩定性>2年。
    2、ConA 濃縮液(600 mM, pH 6.4 乙酸鈉緩沖液)
    稱取49.2g無水醋酸鈉,175.5g氯化鈉,0.5gCaCl2.2H2,0.7 gMgCl2.6H20.7 g MnCl2.4H2,用900 mL 蒸餾水將其溶解逐滴加入冰醋酸調pH為6.4,再用蒸餾水定容至1L。4℃下保存2周。(注意:配制這種復合緩沖液時,pH的調節特別重要,如果pH低于6.4,就會有沉淀物形成,就算pH再調回來,沉淀物也不會溶解。結果會導致緩沖液必須丟棄重新配制。)
    3、ConA 溶液(使用濃度)
    將30ml ConA 濃縮液用蒸餾水稀釋至100ml?,F配現用。
    4、DMSO
    分析純試劑。室溫下可保存5年。
    預處理:淀粉樣品事先用乙醇進行預處理,除去脂質。如果樣品沒有用乙醇進行預處理,在某些樣品中測得的直鏈淀粉含量會低50%。
    實驗步驟:
    A、淀粉預處理
    1、準確稱取淀粉或面粉樣品至10ml的樣品管中。記錄樣品重量精確到0.1mg。
    2、加1ml DMSO至試管,在漩渦混合器中慢速混勻,在沸水浴中加熱直至分散(大約1分鐘)確保淀粉沒有結團結塊。
    3、密封試管,高速混勻。沸水浴加熱15min,再高速間歇混勻。
    4、室溫放置大約5min,加2ml 95%乙醇,混勻,再加4ml乙醇,蓋上蓋子,顛倒混勻。形成淀粉沉淀物,將試管靜止15min(條件允許過夜靜止)。
    5、2000r,5min離心,棄去上清液,倒置在紙巾上10min,確保乙醇全部揮發。在接下來直鏈淀粉和淀粉的測定中使用此沉淀物。
    6、加2ml DMSO到淀粉沉淀物中,將試管沸水浴15min(間或混勻),確保沒有塊狀。
    7、從沸水浴中取出試管,立即加入4ml ConA 溶液,將試管中藥品轉移至25ml容量瓶中。用 ConA 溶液定容。
                    (整個過程必須在2h內完成)
    B、支鏈淀粉- ConA 沉淀物和直鏈淀粉的測定
    1、量取1mlA試劑到2ml的試管中,加0.54ml的ConA 溶液,蓋上蓋子,反復顛倒,混勻。避免樣品起泡。
    2、室溫靜置1h。14000r,10min,室溫下離心。
    3、轉移1ml的上清液到15ml的離心管中,,加3ml100mM醋酸鈉緩沖液,pH4.5,混合藥品。輕輕塞住管口,沸水浴5min,使ConA變性。
    4、將試管在40℃下水浴,平衡5min,,加1ml淀粉轉葡萄糖苷酶和a-淀粉酶的混合物,40攝氏度下反應30min,2000r離心5min。
    5、準確量取1ml上清液,加4ml GOPOD試劑,40攝氏度下反應20min,使空白試劑和D-葡萄糖標準液同時反應。
    6、在510nm下測定每一個樣品和D-葡萄糖標準液的吸光光度值。
    C、總淀粉的測定
    1、將0.5mlA溶液和4ml100mM乙酸鈉溶液混合,pH 4.5
    2、加1ml淀粉轉葡萄糖苷酶和a-淀粉酶的混合物,40攝氏度下反應10min,
    3、準確量取1ml上清液,加4ml GOPOD試劑,40攝氏度下反應20min。這個反應必須讓樣品和標準液按B部分同時進行。

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